串联质谱技术在新生儿遗传代谢性疾病筛查中的应用

宣兆宇    长春市妇幼保健计划生育服务中心新生儿疾病筛查科，吉林 长春 130050

关键词: 串联质谱; 遗传代谢性疾病; 新生儿筛查

•综    述•

中国图书分类号: R722．1    文献标识码: A    文章编号: 1001-4411( 2022) 17-3290-04; doi: 10. 19829 / j. zgfybj. issn. 1001－4411. 2022. 17. 051

遗传代谢性疾病 ( IMD 或 EM) 也称为先天性的代谢障碍或先天性代谢缺陷性疾病 ( IEM) ，是因为体内基因发生改变从而引起参与体内代谢反应的酶、转运蛋白及受体等发生缺陷，导致体内正常代谢反应 被破坏，异常代谢产物增多或降低，从而导致出现相 应临床症状的疾病群^［1－2］。遗传代谢病种类繁多，常   见的有 500 ～ 600 种，总数可能达数千余种，虽然单一病种的患病率较低，属于罕见病，发病率在几万分 之一至几千万分之一，但如果将所有的 IEM 种类相加，则总体发病率较高，有资料报道新生儿遗传代谢 病的患病率在 0. 5% 以上^［3］。串联质谱技术进行遗传代谢性疾病筛查具有较高的灵敏度、特异度及选择性 特点，并且检测时间短、速度快，检测病种多，能做 到一次性检测滤纸干血片样品中多项目标代谢物，即 通过一次检验可以筛查出氨基酸、有机酸、脂肪酸等 代谢异常的多种遗传代谢性疾病，传统检测只能检测 出一种疾病，耗时费力，耗费大量人员、资源成本， 串联质谱筛查技术实现了同时检测多种疾病的转变， 串联质谱技术在遗传代谢性疾病筛查中应用越来越广 泛，大大提高了筛查效率。截止到目前，串联质谱新 生儿遗传代谢病筛查技术在发达国家和发展中国家应 用越来越普遍。因此，本研究旨在探讨串联质谱技术 在新生儿遗传代谢性疾病筛查中的应用价值。

串联质谱技术

质谱检测法主要通过对血标本的质荷比分析实现定性和定量分析的方法，检测原理是应用电磁学的原理，将目标样品离子化为各种带电粒子，带有各种质荷比不同的带电粒子，利用质量分析器，把不同质荷比的离子分开，依据其形成的峰强度曲线及图像谱等对其进行定性和定量的判定分析。串联质谱技术就是串联多个质量分析器，首先通过一级质量分析器，检测被测物质的整体质荷比，根据碰撞碎片，通过二级质量分析器，按照不同的检测模式，得到不同的质谱图像，串联质谱技术是通过对目标样品解离后的各种带电粒子分析，因此具有更高的灵敏度和特异度，实现几分钟内检测一个样品的几十项检测，串联质谱遗

基金项目: 吉林省卫生健康科技能力提升项目 ( 2021JC089)

传代谢性疾病筛查技术是利用串联质谱仪检测目标样品中氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的含量，检测原理是因为遗传因素原因导致体内酶的缺乏，患者正常代谢异常，如氨基酸代谢病异常患者血中氨基酸水平异常，有机酸血症和脂肪酸氧化代谢障碍患者血中游离肉碱或不同种类的酰基肉碱含量异常，因此通过检测不同种类的氨基酸含量筛查氨基酸代谢性疾病，通过检测不同种类的酰基肉碱含量筛查检测有机酸和脂肪酸代谢障碍性疾病。

串联质谱遗传代谢性疾病筛查流程

串联质谱遗传代谢性疾病筛查流程主要包括血标本的采集、晾晒、保存、递送、审核、检测及结果的分析及信息系统数据共享等。

2. 1   血标本的采集、晾晒、递送及保存    血标本在各助产机构及妇幼保健机构采集，在新生儿满足采血条件后，将采集的 3 个血斑滴在美国产的 S＆S903 滤纸上，将血标本置于清洁干燥环境中自然晾干后，放于专用的塑料袋内，密封完好，存放于 2 ℃ ～ 6 ℃ 冰箱里。合格的滤纸干血片交替放置，避免血斑污染。在血标本采集 5 个工作日内由专用运送通道运送到长春市妇幼保健计划生育服务中心新生儿疾病筛查中心。

2. 2 滤纸干血片的处理 用打孔器打取直径为 3 mm 的圆形目标滤纸样本，放入到 96 孔聚丙烯板中，放入样品有质控样品和待检测目标样品，选用衍生化法或者是非衍生化法对滤纸目标样本进行处理。

2. 2. 1    衍生化法    将每个孔内加进 100 μl 含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的甲醇，室温震荡 20 min，存取氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱。将每孔内的液体离 心转移到 96 孔聚丙烯板内，将该板放在氮吹仪上， 加热到一定温度用氮气吹干。随后加入定量的盐酸正 丁醇，用聚四氟乙烯膜全覆盖。放入设置特定温度的 干燥箱中衍生 15 min，将该板放在氮吹仪上加热到指定温度，氮气吹干至完全干燥后在 96 孔板加入定量乙腈，覆盖铝膜，上串联质谱仪检测。

2. 2. 2 非衍生化法   将直径 3 mm 的滤纸干血片样本置于 96 孔过滤板中，包括质控品及待测样品，每孔加入 100   μl 内标工作液，室温震荡 20   min，萃取氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱。将每孔内的液体离心转移到 96 孔聚丙烯板中，覆盖铝膜，上串联质谱仪检测。

2. 3 实验数据获取   衍生后样品串联质谱技术检测方法采用中性丢失扫描、多反应监测扫描和母离子扫描的方式来获取数据信息，非衍生化后处理的样品均采用多反应监测扫描方式获取数据，主要是全扫描和选择性扫描方式获得数据。全扫描的特点是实验方法简单易行，数据全面，是对指定质荷比范围内的离子进行全部扫描，可以获取大量数据，选择性扫描的优势是采集数据具有特异性特点，只采集为特定的离子，但是成本较高，因为检测指标需要特定验证。进行遗传代谢性疾病分析时，如果将这 3 种形式的扫描方式相结合运用，可以保证结果的高度准确性。通过质谱检测仪器配套的遗传性代谢性疾病数据信息系统软件分析统计，将扫描得出的曲线图谱像及离子峰强度等转化为对应的目标代谢物的绝对浓度值。非衍生化法样本处理简化了实验操作工作流程，而且在实验过程中工作人员不需要特殊的防护处理，因为所用试剂为无毒化学试剂。有研究表明利用非衍生化法做串联质谱遗传代谢性疾病实验检测所占的比率正逐年提高，由此可以证明简单、易行、无毒、无害、快速及易操作性的非衍生化样品处理方式是目前新生儿遗传代谢性疾病筛查的发展研究方向^［4］。

2. 4   串联质谱结果分析   由于串联质谱仪器是一种

复杂的仪器，串联质谱技术具有较高的灵敏度，不同 的生产厂家制造的仪器设备、实验检测的整体环境及 样本处理方式方法等都会对实验结果的准确性有不同 程度的影响，因此开展串联质谱遗传代谢病筛查的机 构要结合实际情况，设定正常值参考范围^［5－7］。定量   分析是凭借串联质谱遗传代谢病筛查专用软件统计出 的数据进行处理，总结出的检测数据既可以是依据目 标代谢物的绝对浓度，也可以是依据代谢物与内标或 几种关联代谢物之间的离子峰度比。根据样品中氨基 酸和酰基肉碱对应的同位素内标的离子峰强度自动算 出所测样品中氨基酸和酰基肉碱浓度。有专家研究分 析数据处理方法对结果分析有很大影响，如检测丙酰 基肉碱 ( C3) 和丙酰基肉碱/ 乙酰基肉碱 ( C3 / C2) 增高项目对确诊甲基丙二酸血症 ( MMA) 具有重要意义，但急性期甲基丙二酸血症患儿进食少或有呕 吐，会因为肉碱摄入量不够，导致体内游离肉碱的水 平要降低， 因此结合的肉碱即酰基肉碱 ( 如 C2、C3) 含量也会相应降低，这样血 C3 扔可在正常范围，但与其他酰基肉碱的比值 ( 如 C3 / C2) 仍是增高。除此之外，其他疾病引起酸中毒时可导致继发性 血 C3 轻度增高而 C3 / C2 往往正常^［8］。在中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症 ( MCAD) 中，由于代谢酶的缺乏，患者血中 C8－酰基肉毒碱异常升高，然而若仅依据 C8－酰基肉毒碱浓度进行筛查，结果的准确性明显劣于 C8－酰基肉毒碱/ C0 － 游离肉毒碱或 C8 － / C2 － 酰基肉毒碱的比值^［9－10］，也有资料报道如在苯丙酮尿症 ( PKU) 患儿体内，因为缺少苯丙氨酸羟化酶，导致苯丙氨酸 ( Phe) 不能正常代谢成酪氨酸 ( Tyr) ，随着时间的变化，苯丙氨酸浓度会不断积聚累加，而酪 氨酸浓度会持续减少 ( 通过饮食的摄入量不足以维持其水平) ， 因此，Phe / Tyr 比值与 Phe 浓度相比， 作为筛查检测参考指标则会更加灵敏准确，可以减少 假阴性率的发生^［11］。有专家也提出在分析串联质谱数据时，应考虑到体内某些代谢物的异常代谢变化可 能来源于不同疾病，因此也提出在分析串联质谱检测 数据时，必须结合参考临床症状和其他检验等项目， 并要排除鉴别其他疾病，以保证筛查结果和数据分析 的准确性^［12］。

筛查现状

串联质谱遗传代谢性疾病筛查技术具有高度的灵 敏性、高度的特异性、高度的选择性及快速检测的特 点，于二十世纪 90 年代开始应用筛查检测，是由国外发达国家率先发展起来的一项新技术，传统的新生   儿疾病筛查只能通过一次实验检测出一种疾病，而使   用串联质谱技术则可以在几分钟内检测到数十种氨基   酸、有机酸及脂肪酸代谢障碍性疾病，能同时一次性   检测几十种遗传代谢病，实现了一种实验可以同时检 测多种疾病的飞 跃^{［13－14］}。1990   年美国杜克大学( Duke University) Dr. Millington 提出利用串联质谱 ( MS / MS) 技术进行新生儿疾病筛查，通过检测样品中氨基酸、酰基肉碱的含量，诊断出多种氨基酸、有   机酸、脂肪酸代谢障碍疾病，至此，美国开始利用快 速、可靠的串联质谱技术来开展筛查遗传代谢性疾 病，使得新生儿疾病筛查的病种扩大到 30 多种。目前欧、美、澳洲等国家都已经普及串联质谱疾病筛 查。自从 Millington 等 1990 年首次应用串联质谱技筛查新生儿遗传代谢性疾病以来，经过几十年的不断发 展与研究探索，串联质谱技术现已经成为 IMD 筛查中最理想的手段，并且能够明显降低假阳性和假阴性 的发生率^［15］。有报道筛查苯丙酮尿症数十万例，达到了零错误率。国内是在 2002 年，由上海新华医院率先在全国开展启用 MS / MS 进行遗传代谢病筛查^［16］。近几年来，国内很多地区，如浙江、江苏、湖南及安徽等地基本都开展了串联质谱遗传代谢病筛   查技术。长春市妇幼保健计划生育服务中心新生儿疾 病筛查中心于 2017 年开始开展串联质谱遗传代谢性疾病筛查，依托于辖区助产机构－县 ( 市) 区级妇幼保健机构———长春市新生儿疾病筛查中心三级筛查网络开展工作。

存在问题和改进措施

4. 1    覆盖面未达到 100%，筛查率偏低    长春地区

现有多家助产机构未开展此项筛查工作，目前长春地区辖区助产机构的筛查覆盖面未达到 100%。自开展该项工作以来，截止到 2021 年 9 月 30 日，累计筛查

新生儿为 22 812 例，4 年来平均筛查率仅为 12. 90%， 串联质谱遗传代谢病筛查对保障人口优生优育、预防 出生缺陷、降低病残儿数量、完成经济社会发展提高 人口预期寿命、受教育年限等主要指标情况、提高出 生人口素质、建设健康中国及构建和谐社会都具有重 大意义。因此要进一步加大对新生儿遗传代谢性疾病 筛查的覆盖面和支持力度，强化政策引导，目前长春 地区筛查费用主要是自费，建议提供多种形式的补助 或减免措施。要进一步扩大宣传面，社区卫生服务中 心、助产机构及县 ( 区) 级妇幼保健机构要加强对串联质谱遗传代谢病筛查的宣传工作，在孕前、孕 中、新生儿期全周期不断为孕产妇及家属普及相关知 识，并充分利用电视、广播、宣传板、微信公众号等 媒体平台及制作大众喜闻乐见、通俗易懂的健康教育 科普进行筛查工作的宣传、普及，提高全民串联质谱 遗传代谢病筛查意识。

4. 2    发病率高，明显高于其他省份和城市    遗传代谢病多属于罕见病，遗传代谢病个体发病率低，但整 体患病率较高，有资料^{［17－23］}显示，吉林省新生儿疾病筛查中心检出率为 1 /2 451，浙江省新生儿疾病筛查中心检出率为 1 /5 626，山西省筛查中心检出率为1 /1 656，甘肃省筛查中心检出率为 1 /3 248，合肥市新生儿疾病筛查中心检出率为 1 /2 840，上海市新华医院检出率为 1 /3 483， 济宁市筛查中心报道为 1 /1 178，长春市新生儿疾病筛查中心选取 2017 年10 月1 日—2021 年 9 月 30 日进行串联质谱遗传代谢病筛查的 22 812 例新生儿作为研究对象。检出遗传代谢性疾病 31 例，检出率为 1 /736，明显高于其他省份和城市，因此，要高度重视长春地区发病情况， 进一步加强科室建设，引进专业技术人才，完善新生   疾病筛查管理模式，优化新生儿疾病筛查网络信息化 管理流程，补齐实验室短缺试验设备，配备先进的筛   查、诊断仪器，提高综合能力，打造筛查、检测、诊   断及治疗一体化体系建设的重点科室，建设一个集筛   查、检验、诊疗、科研及教学为一体的高级别、高水   平的新生儿疾病筛查中心，为研究我市遗传代谢病的 发病情况、影响因素及干预手段等搭建平台，确保患   病儿童都能做到及早发现、精准诊断及有效治疗，避   免发生残疾或降低残疾发生程度，为长春地区有效干 预防控出生缺陷、提高出生人口素质建言献策及制定 政策等行政干预项目提供有力的数据支撑。

4. 3    筛查意识不强，可疑阳性复筛率低    2017 年

10 月1 日—2021 年 9 月 30 日需要复筛可疑阳性数为

585 例，召回可疑阳性数为 411 例，召回复筛率为

70.   26%，可疑阳性群体为高危群体，确诊患儿概率

高，现有的召回率不能做到高危群体复筛全覆盖，因   此，要进一步加强可疑阳性复查管理，强化遗传代谢   病实验室质量控制，提高检测水平，把假阳性报告降 为最低。提升与新生儿家属沟通和交流的技巧，在对   筛查报告进行准确解读与解疑的基础上，给予人文关   怀，消除家属过度紧张情绪，积极配合复筛工作。三级筛查网络平台要密切配合，相互协作，动员社 区、街道等多方参与，确保可疑阳性新生儿尽早复 查，及时发现患病儿童。遗传代谢病的特点要早发 现、早诊断及早治疗，一旦错过最佳治疗时期，则会   发生不可逆的智力和身体残疾，严重者甚至会发生死 亡，及早干预和治疗，会降低或避免部分残疾患儿发 生，明显提高儿童健康水平，具有重大的社会效益和 经济效益。

4. 4    基础和临床研究力量薄弱，疾病诊治病种单一

在串联质谱技术应用于新生儿遗传代谢性疾病筛查 已经日趋成熟的条件下，新型检测技术的研发和运用 将会进一步提升筛查的技术水平，高效液相色谱、高   分辨气相色谱、气相色谱/ 质谱联用等技术的综合运用将使新生儿遗传代谢性疾病的诊断更为快捷和准 确。基因组测序也会成为新生儿遗传代谢性疾病筛查   的手段^［24］。遗传代谢性疾病病理和诊断研究复杂， 诊断手段有限，往往需要多学科配合和支持。我中心   对遗传代谢性疾病生化和分子遗传学的深入研究还需 要进一步充实人员力量，选派业务骨干到国际国内成 熟的、经验丰富的筛查诊治中心、三甲级综合医院小 儿内分泌科、遗传代谢病科学习，要依托专业技术人 员深入研究遗传代谢病，补齐短板，配齐综合配套辅 助检查和检测化验项目，不断扩大新生儿遗传代谢病 的筛查项目及诊治病种。随着遗传代谢病研究的深 入，遗传代谢病可筛查可治疗的病种越来越多，本中   心现只开展单一的高苯丙氨酸血症干预和治疗，已不   能满足确诊患儿的需求，因此要逐步开展串联质谱筛 查出的多种遗传代谢病的治疗，要不断提高筛查技术 水平和提升干预诊治能力。同时要争取更多的救助项 目，动员社会力量广泛参与，建立长效、稳定的救助   机制，遗传代谢病筛查的最终目的就是治疗确诊患 儿，避免残疾，往往有一部分患儿因为家庭贫困放治 疗，要避免因病致残、因贫致残，因残返贫，确保脱   贫攻坚成果。遗传代谢病的干预治疗是个系统工程， 需要社会、家长及诊治机构等多方的参与和努力，才   能确保长春地区遗传代谢病的防控和诊治提升一个新 高度，切实提高长春地区出生人口素质和儿童的健康 水平。

参考文献

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