DOI: 10． 13602 / j． cnki． jcls． 2016． 12． 01    •述评•

液相色谱 － 串联质谱技术的临床应用进展

李水军¹ ，王思合² ( 1． 上海市徐汇区中心医院中心实验室 复旦大学附属中山医院徐汇医院/ 中国科学院上海临床研究中心，上海 200031; 2． 美国克利夫兰医学中心病理与检验医学研究所，美国克利夫兰 44195)

摘要: 液相色谱 － 串联质谱技术( liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS / MS) 与免疫学方法相比具有特异性高、灵敏度高、多组分检测能力等方面的优势，已经成为临床检验领域重要的新技术之一。目前 LC-MS / MS 主要在激素检测、新生儿筛查、治疗药物监测、维生素 D 代谢物检测、蛋白质与多肽定量等项目应用比较成熟。虽然 LC-MS / MS 技术凭借其独特的优势，已经在临床检验领域占得一席之地，但也存在自动化及标准化程度低、仪器操作复杂等不足。自动化、标准化、蛋       白质定量、高分辨质谱等将是今后 LC-MS / MS 在临检应用的主要发展方向。

关键词: 液相色谱 － 串联质谱技术; 临床实验室; 临床应用; 临床检验

中图分类号: O657． 63; O657． 7    文献标志码: A

液相色谱 － 串联质谱技术( liquid chromatogra- phy-tandem mass spectrometry，LC-MS / MS) 是近 20 年来快速发展并成为临床检验领域最富有生命力的新技术之一。LC-MS / MS 技术在美欧等西方国家中的临床应用非常广泛，已经成为激素检测、新生儿筛查、治疗药物监测等常规应用方法。LC-MS / MS 技术使得许多疾病得以准确、快速、经济地检测和诊断，发挥其他方法不可替代的作用。LC-MS / MS 技术在特异性、灵敏度、多组分检测能力等方面具有明显的优势，可以较好地克服免疫学方法的不足，在临床检验领域其价值得到充分展现。随着质谱仪灵敏度不断提高、样品处理技术持续改进、方法标准化和试剂的研发上市，可以预见 LC-MS / MS 技术将成为临床检验常规应用的重要组成部分，在临床诊断中发挥举足轻重的作用。

激素

激素检测是目前临床化学领域最具挑战性的方 法，因为: ( 1) 许多激素具有相似的化学结构，对方法的特异性要求高; ( 2) 大多数激素的浓度很低，有结合、游离形式和性别、年龄之分，对方法的灵敏度 要求高。如睾酮检测，用现有的免疫学方法检测男 性睾酮水平性能尚可，但是难以准确检测妇女、儿童的睾酮水平^［1］，因为二者的睾酮水平只有成年男性的 1 /20   ～ 1 /10，检测可靠性大打折扣^［2］，其结果的临床参考价值可想而知。而用LC-MS / MS 方法却能便捷、准确的检测妇女、儿童的睾酮水平^［3］，此外，睾酮的参考方法也有采用 LC-MS / MS 检测原理的^［4］。( 3) 对于某些复杂的疾病，由于代谢通路障碍，影响该通路上多种激素，需要同时检测多个激素。如先天性肾上腺皮质增生症的诊断可能需要同时检测 17-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、皮质醇等一系列的激素，才能对代谢障碍的具体类型准确区分^［5］，对方法的检测通量要求高。

类固醇激素分为糖皮质激素、盐皮质激素和性 激素，糖皮质激素包括皮质醇、可的松、皮质酮等。

目前已有用 LC-MS / MS 测定血浆、唾液或者尿液中糖皮质激素的报道，特别是游离皮质醇或者唾液皮 质醇和可的松，由于浓度较低，加上有干扰，免疫学 方法无法对可的松进行检测，故而 LC-MS / MS 优势突出^［6-7］。盐皮质激素是一类影响水盐平衡的类固醇激素，主要的内源性盐皮质激素是醛固酮，其浓度 很低( pg / mL 级水平) ，因此对方法的灵敏度和特异性要求很高。最近有学者采用LC-MS / MS 测定血浆或者尿液中醛固酮，固相萃取法处理样品，其灵敏度 比免疫学方法高 10 倍^［8-9］。性激素包括雄激素、雌激素、孕激素，常见的检测项目包括睾酮、雌二醇、孕   酮等，这些激素因性别、年龄和生理状态不同，浓度 差别很大，只有灵敏度高、线性范围广的方法才能覆 盖不同情况下的检测浓度。Taieb 等^［10］比较了多种免疫学方法和质谱法，认为在睾酮预期浓度非常低 的儿童和妇女中，没有一种免疫学方法能够可靠地 测定血清睾酮浓度，因为其灵敏度无法达到要求。雌二醇的浓度则更低，比如绝经后妇女或者男性体 内的雌二醇，准确测定有一定难度。大多数免疫学 方法可测到 10 pg / mL 的浓度水平，但其精密度较差，LC-MS / MS 法的最低检测限可 ＜ 4   pg / mL^［11-12］。除了上述提到的类固醇激素，还有变肾上腺素和儿茶酚胺类^［13-14］、甲状腺激素^［15］等，LC-MS / MS   都可以进行检测。

新生儿筛查

遗传代谢病种类多，但发病率低，新生儿筛查是 诊断先天性代谢缺陷的最主要手段。20 世纪 90 年代，质谱技术开始用于新生儿筛查。不同于以往每 次只检测一种分析物，质谱技术可以在数分钟内同 时测量几十种分析物，检测通量大大提高。现在可 用于氨基酸、有机酸和脂肪酸等多种代谢缺陷病，实 现高通量筛查，开辟了新生儿筛查新的领域^［16-17］。 质谱技术具有明显的优点: ( 1) 检测通量高，数分钟内可检出几十种遗传代谢病，适于大规模筛查; ( 2) 检测准确性高，可监测各种分析物的比值，假阳性、假阴性率低; ( 3) 采用干血点作为检材，用血量少， 易采集、易保存和运输，省时方便。美国是最早开展 质谱技术新生儿筛查项目的国家，澳、英、德、日、韩   等国也已将质谱技术列为常规筛查项目。我国的上 海、浙江、广州等地分别于 2005 年后开始应用质谱技术开展新生儿筛查，筛查覆盖率不断提高^［18］。

治疗药物监测

治疗药物监测( TDM) 主要针对治疗指数低、个体差异大的药物，其核心是以血药浓度为指标，个体 化调整用药方案，变经验用药为科学用药，实现安全 有效、经济合理的治疗目标。由于 LC-MS / MS 在靶向定量分析独具优势，早期在药物生物分析领域已 经得到成熟应用。LC-MS / MS 可以在单次检测中同时定量分析多个化合物，对于一些合并给药如免疫 抑制剂、抗病毒药物、有活性代谢物、有干扰的代谢物等情况，LC-MS / MS 特别有吸引力，有力地推动临床实验室利用 LC-MS / MS 建立药物分析方法，用于治疗药物监测^［9］。目前 LC-MS / MS 在 TDM 的应用几乎囊括了所有需要监测的药物，如免疫抑制剂、抗 病毒药物、抗癫痫药物、抗抑郁药物、抗真菌药物、抗   心律失常药物、抗生素、抗肿瘤药物及非法滥用药物   等^［19］。有研究报道，采用 LC-MS / MS 平台可同时检测西罗莫司、他克莫司、环孢素 3 种免疫抑制剂，成功地替代原有的化学发光微粒免疫分析平台，是更 简单、快速、经济的方法，可大大节约成本^［20］。虽然手工操作在 LC-MS / MS 不可避免，现在已经出现诸如在线固相萃取、移液机器人等自动化设施，部分替 代手工操作，用以简化步骤，提高通量^［9］。在临床实践中，还有非法药物滥用( 如使用毒品) 的情况，

需要对疑似滥用或者中毒的病例进行药物筛选和定量。通常采用尿液药物筛查，对检测通量和检测灵敏度要求比较高，用 LC-MS / MS 进行筛查应该是较好的选择^［21］。

维生素 D 代谢物

LC-MS / MS 检测维生素的应用中，维生素 D 代谢物的临床应用发展最为迅猛，数量最多，影响最大。从 2000 年至 2010 年，美国联邦医疗保险中每10 000 个 B 类医保报销的临床检测中有 1 300 个是维生素 D 代谢物的测试，10 年增长了 83 倍^［22］。维生素 D 的缺乏在普通人群( 一般人群) 极为常见，据统计亚洲地区有 78% ～ 98% 的普通人群和 45% ～ 98% 的孕妇缺乏维生素D，即25-羟基维生素 D 水平低于 20 ng / mL^［23］。25-羟基维生素 D( 25OHD) 是衡量维生素 D 营养状态的最佳指标。LC-MS / MS 具有特异性强、准确性高的特点，可同时检测 25-羟基维生素D2 和25-羟基维生素 D3，被认为是评价维生素 D 营养状况的“金标准”测定法^［24］。由于 25OHD 的测定结果直接影响维生素 D 的营养状况的临床判断，测定结果准确与否、不同的测定方法之间是否一致，就显得至关重要。经过比较发现，基于不同的原理和操作程序的 25OHD 测定方法之间，存在较大的差异^［25］。而建立标准测试程序，参加室间质量评价 计划，应用商业化检测试剂盒，将有助于进一步改进25OHD 测定结果的室间可比性^［26］。1，25-二羟基维生素 D 对评价高钙血症、高磷血症、高镁血症和高PTH 血症、佝偻病和肉芽肿患者及肾病患者具有一定的临床意义^［27］。但是检测 1，25-二羟基维生素 D也具有更大挑战，因为其浓度比 25-羟基维生素 D 低 1 000 倍，离子化效率很低，需要通过衍生化、增大样本体积、亲和纯化等方法提高灵敏度^［27-28］。

蛋白质与多肽

由于电喷雾离子化( ESI) 技术和基质辅助激光解吸电离(   MALDI)   技术的发明，LC-MS / MS 的稳健性和灵敏度的不断改进，LC-MS / MS 的蛋白质和多肽定量检测已逐渐成为传统免疫方法之外的可选方法。LC-MS / MS 无需特殊的抗体试剂，是检测翻译后修饰较好的工具^［29］。近年来，不断有新的 LC- MS / MS 蛋白质和多肽应用方法见诸报道，包括 C 肽^［30］、胰岛素^［31］、甲状腺球蛋白^［32］、甲状旁腺激素^［33］、糖化血红蛋白( HbA1c) ^［34］等。样本处理主要采用胰酶水解蛋白质，形成多肽，应用同位素标记多肽作为内标，用多反应监测( MＲM) 检测其中特异的肽段。LC-MS / MS 检测具有临床意义的蛋白质是临床诊断中相对较新的发展，有望今后为临床提供更多结果可靠、经济适用、高通量、多组分的蛋白质和多肽分析平台。虽然LC-MS / MS 在蛋白质和多肽分析锋芒初试，但是要变成临床常规应用的技术，还需要克服一些技术障碍，包括提高仪器灵敏度和分析准确度，改善样品处理自动化程度、蛋白质富集技术、同位素内标等^［29］。

展望

毫无疑问，LC-MS / MS   具有鲜明的特点。与现有的免疫技术相比，LC-MS / MS 有灵敏度高、特异性好等方面的优点，但也存在自动化低、仪器复杂、初期投资大的不足。无论如何，LC-MS / MS 技术凭借其独特的优势，已经在临床检验领域占得一席之地， 与免疫技术互补长短。随着一些技术瓶颈不断突 破，LC-MS / MS 在临床检验领域前景看好。提高自动化，减少手动操作带来的繁琐和人为误差，增加检 测通量，将是未来 LC-MS / MS 发展的方向之一，今后需要在样品条码生成与识别、样品处理、色谱分析、质谱检测、数据读取、结果报告等流程进行深度整 合，全面提高 LC-MS / MS 在临床检验的竞争力^［35］。标准化的缺乏是目前LC-MS / MS 临床应用的另一个技术瓶颈^［36］。目前 LC-MS / MS 临床检验方法绝大多数为实验室自行建立，采用的试剂未得到国家食 品和药品监督管理局( CFDA) 审批，检测方法难以溯源到参考标准品或者参考方法，检测结果的准确 度、重复性、室间可比性有待临床进一步验证。目前 虽有部分批准认可的 LC-MS / MS 检测试剂盒，但是品种和数量还难以满足临床检验的需求。LC-MS / MS 用于蛋白质和多肽定量检测引起临床实验室的广泛兴趣。随着稳定同位素稀释质谱的应用，加上 样品提取富集如免疫亲和技术的不断改进，可以预见LC-MS / MS 在蛋白质和多肽的检测将会是活跃的发展方向。现有的LC-MS / MS 方法主要用于靶向定量，对已知化合物具有较好的分析定量性能。高分 辨质谱可以获得分析物的准确质量数、元素组成和 结构信息，分辨率高，可以进行全扫描和靶向扫描， 适合大规模筛查应用^［37］。但是目前高分辨质谱仪价格昂贵，定量性能还有待提高，今后如在这些方面 有所改观，高分辨质谱的临床应用无疑会有更广阔 空间。

参考文献

［1］Ｒosner W，Auchus ＲJ，Azziz   Ｒ，et   al．   Position   statement:   Utility， limitations，and pitfalls in measuring testosterone: An endocrine soci- ety   position   statement［J］．   J Clin   Endocrinol   Metab，2007，92( 2) : 405-413．

［2］Herold DA，Fitzgerald ＲL． Immunoassays for testosterone in women: Better than a guess? ［J］．    Clin Chem，2003，49( 8) : 1250-1251．

［3］Thienpont   LM，Van   Uytfanghe   K，Blincko   S，et   al．   State-of-the-art of serum testosterone measurement by isotope dilution-liquid chroma- tography-tandem mass spectrometry［J］．   Clin   Chem，2008，54( 8) : 1290-1297．

［4］Tai SS，Xu B，Welch MJ，et al．    Development and evaluation of a candidate reference measurement procedure for the determination of testosterone in human serum using isotope dilution liquid chromatog- raphy / tandem mass spectrometry［J］．    Anal Bioanal Chem，2007， 388( 5-6) : 1087-1094．

［5］Magnisali   P，Chalioti MB，Livadara T，et al．   Simultaneous quantifi- cation of 17alpha-oh progesterone，11-deoxycortisol，delta4-andro- stenedione，cortisol and cortisone in newborn blood spots using liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．   J Chromatogr B Ana- lyt   Technol   Biomed   Life   Sci，2011，879( 19) : 1565-1572．

［6］Fong   BM，Tam   S，Leung   KS．   Improved   liquid   chromatography-tan- dem mass spectrometry method in clinical utility for the diagnosis of cushing＇s   syndrome［J］．    Anal   Bioanal   Chem，2010，396 (   2 ) : 783-790．

［7］Ｒaff   H，Singh   ＲJ．   Measurement   of   late-night   salivary   cortisol   and cortisone by lc-ms / ms to assess preanalytical sample contamination with topical hydrocortisone［J］．   Clin Chem，2012，58( 5) : 947-948．

［8］Taylor PJ，Cooper DP，Gordon ＲD，et al．    Measurement of aldoste- rone in human plasma by semiautomated hplc-tandem mass spectrom- etry［J］．    Clin Chem，2009，55( 6) : 1155-1162．

［9］Leung KS，Fong BM．    Lc-ms / ms in the routine clinical laboratory: Has its time come?    ［J］．    Anal Bioanal Chem，2014，406 ( 9-10 ) : 2289-2301．

［10］Taieb J，Mathian B，Millot F，et al．    Testosterone measured by 10 immunoassays and by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry in sera from 116 men，women，and children［J］． Clin Chem，2003，49( 8) : 1381-1395．

［11］Kushnir MM，Ｒockwood AL，Bergquist J，et al．    High-sensitivity tandem mass spectrometry assay for serum estrone and estradiol［J］． Am J Clin Pathol，2008，129( 4) : 530-539．

［12］Guo   T，Gu   J，Soldin   OP，et   al．   Ｒapid   measurement   of   estrogens and their metabolites in human serum by liquid chromatography-tan- dem mass   spectrometry   without   derivatization［J］．   Clin   Biochem， 2008，41( 9) : 736-741．

［13］Marney LC，Laha TJ，Baird GS，et al． Isopropanol protein precipi- tation for the analysis of plasma free metanephrines by liquid chro- matography-tandem mass spectrometry［J］．    Clin Chem，2008，54 ( 10) : 1729-1732．

［14］Peitzsch   M，Prejbisz A，Kroiss M，et al．   Analysis of plasma 3-me- thoxytyramine，normetanephrine and metanephrine by ultraperfor-

mance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Utility for diagnosis of dopamine-producing metastatic phaeochromocytoma

［J］．    Ann Clin Biochem，2013，50( Pt 2) : 147-155．

［15］Yue B，Ｒockwood AL，Sandrock T，et al．   Free thyroid hormones in serum by direct equilibrium dialysis and online solid-phase extrac- tion--liquid   chromatography / tandem   mass   spectrometry［J］．   Clin Chem，2008，54( 4) : 642-651．

［16］Pitt JJ．    Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry    in    clinical    biochemistry ［J］．    Clin    Biochem    Ｒev， 2009，30( 1) : 19-34．

［17］Wilcken B，Wiley V，Hammond J，et al．    Screening newborns for inborn errors of metabolism   by tandem   mass spectrometry［J］．    N Engl J Med，2003，348( 23) : 2304-2312．

［18］赵正言．   国际新生儿疾病筛查进展［J］．   中国儿童保健杂志，

2012，20( 3) : 193-195．

［19］Adaway JE，Keevil BG． Therapeutic drug monitoring and lc-ms / ms

［J］．    J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，883- 884: 33-49．

［20］Hetu PO，Ｒobitaille Ｒ，Vinet B．    Successful and cost-efficient re- placement of immunoassays by tandem mass spectrometry for the quantification of immunosuppressants in the clinical laboratory［J］．      J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，883-884: 95-101．

［21］Yuan   C，Heideloff   C，Kozak   M，et al．   Simultaneous quantification of 19 drugs / metabolites in urine important for pain management by liquid   chromatography-tandem   mass   spectrometry［J］．   Clin   Chem Lab   Med，2012，50( 1) : 95-103．

［22］Shahangian S，Alspach TD，Astles JＲ，et al．    Trends in laboratory test volumes for medicare part b reimbursements，2000-2010［J］． Arch Pathol Lab Med，2014，138( 2) : 189-203．

［23］Hossein-nezhad A，Holick MF． Vitamin d for health: A global per- spective［J］．    Mayo Clin Proc，2013，88( 7) : 720-755．

［24］Wang S．    Epidemiology of vitamin d in health and disease［J］． Nutr Ｒes Ｒev，2009，22( 2) : 188-203．

［25］Ｒoth HJ，Schmidt-Gayk H，Weber H，et al．   Accuracy and clinical implications of seven 25-hydroxyvitamin d methods compared with liquid chromatography-tandem mass spectrometry as a reference［J］． Ann   Clin   Biochem，2008，45( Pt 2) : 153-159．

［26］李水军，王思合，周建烈，等． 维生素 d 代谢及 25-羟基维生素d 测定方法研究进展［J］．   国际检验医学杂志，2012，33 ( 24) : 3028-3030．

［27］Yuan C，Kosewick J，He X，et al． Sensitive measurement of serum

1alpha，25-dihydroxyvitamin    d    by    liquid    chromatography / tandem mass spectrometry after removing interference with immunoaffinity extraction［J］．    Ｒapid Commun Mass Spectrom，2011，25 ( 9 ) : 1241-1249．

［28］Hollis BW，Horst ＲL．    The assessment of circulating 25 ( oh) d and 1，25( oh) 2d:    Where we are and where we are going［J］． J Steroid Biochem Mol Biol，2007，103( 3-5) : 473-476．

［29］Ｒauh M． Lc-ms / ms for protein and peptide quantification in clinical chemistry［J］．    J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2012，883-884: 59-67．

［30］Kinumi T，Mizuno Ｒ，Takatsu A． Quantification of serum c-peptide by isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrome- try: Enhanced detection using chemical modification and immunoaf- finity purification［J］．    J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2014，953-954: 138-142．

［31］Chen   Z，Caulfield   MP，McPhaul MJ，et al．   Quantitative insulin a- nalysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry in a high-throughput   clinical laboratory［J］．   Clin Chem，2013，59( 9) : 1349-1356．

［32］Kushnir MM，Ｒockwood   AL，Ｒoberts   WL，et   al．   Measurement   of thyroglobulin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in serum and plasma in the presence of antithyroglobulin autoantibodies

［J］．    Clin Chem，2013，59( 6) : 982-990．

［33］Kumar V，Barnidge DＲ，Chen LS，et al．    Quantification of serum 1-84 parathyroid hormone in patients with hyperparathyroidism by immunocapture in situ digestion liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］．    Clin Chem，2010，56( 2) : 306-313．

［34］Kaiser P，Akerboom T，Molnar P，et al．   Modified hplc-electrospray ionization / mass spectrometry method for hba1c based on ifcc refer- ence measurement procedure［J］．   Clin Chem，2008，54( 6) : 1018- 1022．

［35］Zhang YV，Ｒockwood A． Impact of automation on mass spectrome- try［J］．    Clin Chim Acta，2015，450: 298-303．

［36］Li S． Standardization of lc-ms / ms in clinical laboratory［J］． J Chro- matogr Sep Tech，2015，6: e128．

［37］Jiwan JL，Wallemacq P，Herent MF．    Hplc-high resolution mass spectrometry in clinical laboratory? ［J］．    Clin Biochem，2011，44 ( 1) : 136-147．

( 收稿日期: 2016-11-08)

( 本文编辑: 许晓蒙)

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